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    东北地区北苍术病害调查及种类鉴定

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    点击次数:546 更新时间:2019年12月28日17:19:43 打印此页 关闭

    1 材料与方法1 病害调查及病样采集2011年5月2015年10月对辽宁省抚顺、清原和新宾等  个主要北苍术 (A.chinensis)种 植 区(表1)进行病害调查。采用五点取样法,每点随机调查100株,每块地重复3次,统计病害种类以及每种病害的危害部位、症状 和危 害 程 度,并 拍 照 记录;调查每种病害的病株数和病叶数,分别计算病株率和病叶率。在田间采集具有典型症状的苍术带回实验室,进行分离、鉴定。病株率(%)=发病株数/调查总株数×100;病叶率(%)=发病叶片数/调查总叶片数×100。1.2 病原菌分离与鉴定采用常规组织分离法进行病原菌分离,于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上纯化培养后置于4冰箱保存备用。利用光学显微镜观察病原菌形态特征,结合形态学和分子鉴定,参照相关文献明确其病害种类。1.3 致病性测定根据柯赫氏法则,在实验室内进行回接北苍术试验。取健康的2年生北苍术叶片,用75%乙醇表面消毒后置于铺有保湿滤纸片的保鲜盒内培养。苍术叶斑病和炭疽病采用菌悬液喷雾接种,孢子悬浮液浓度为 106个/mL,分别喷雾接种到  个北苍术叶片上,以喷无菌水作对照。苍术菌核病采用菌丝块接种2年生北苍术根。接种后喷雾保湿并封闭保鲜盒,置于 28条件下诱导发病,每天观察并记录发病情况。试验重复3次。

    2 结果与分析2.1 北苍术病害种类及危害情况调查结果表明,近年来辽宁省北苍术主要病害有3种,分别为苍术菌核病、苍术叶斑病和苍术炭疽病。苍术菌核病多发生于早春,一般在4月中上旬开始发病,4 月下旬至  月为发病盛期。该病主要分布在清原、抚顺、本溪、沈阳等地,病株率较低,其中清 原 地 区 发 病 相 对 重,病 株 率 为 4.8% ~9.9%,其他地区零星发生,发病率均低于5%,但病株死亡率高,均达90%以上。苍术叶斑病和炭疽病为辽宁省新发生病害,其中苍术叶斑病分布十分广泛且危害严重,各调查种植区均有分布,以清原地区发病较为严重,病株率约为15.1%~100.0%,病叶率约为35.2%~91.8%。该病在6月中下旬至10月份均有发生,8月中上旬至9月上旬为发病盛期。苍术炭疽病仅在抚顺、本溪和沈阳发生,抚顺地区发病相对较重,病株率 约为 25.0% ~40.4%,病叶率约为14.9%~54.1%,本溪和沈阳地区该病发生程度相对较轻,病株率低于 25%,其他县(市)均未见发生(表1)。该病6月下旬开始发病,8月下旬为盛发期,具有明显发病中心,一旦病害发生,蔓延极快,常致叶片成点状成批枯死

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    2.2 辽宁省北苍术病害症状及病原2.2.1 苍术菌核病苍术菌核病主要危害根及根茎部,也可危害茎基部。发病初期,根部和茎基部出现褐色至黑褐色腐烂,病健交界不明显,皮层腐烂易露出里层纤维组织,受害植株地上部分底层叶片先开始变黄、枯萎,逐渐向上蔓延,湿度大时病株根茎及附近土表出现白色棉絮状菌丝,后期形成卵圆形或不规则形、直径0.8~6.9mm 的黑色菌核,严重时甚至全株枯死(图1a~b)。田间未发现子囊盘形成。病菌在 PDA 上形成圆形菌落,气生菌丝发达,绒毛状,初期白色,后期呈肉桂色。7d后培养皿边缘气生菌丝较浓厚处首先集结形成突起,初期较小、乳白色,随后突起逐渐膨大,颜色加深,形成球形或近球形、直径约0.5~4.5 mm 黑色菌核,菌核之间有白色菌丝 分 布。部分菌核延长 或 融 合 成 不 规 则形,并紧贴于培养基表面(图1c~d)。菌丝直角分支,有隔(图1e),通过该病的田间危害症状、病原的形态特征及ITS鉴定,可确定病原菌为雪腐核盘菌.

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    2.2.2 苍术叶斑病苍术叶斑病主要危害叶片,底层老熟叶片发病重,也可危害茎部。受害植株叶片形成中央白色、边缘黑褐色的圆形或不规则形病斑,随后病斑扩大、汇合,湿度大时产生黑色分生孢子器,埋生或半埋生于叶片表皮层。田间发病多分散,存在多个病害中心,降雨后病害程度明显加重(图2a~b)。病菌在 PDA 上菌落近圆形,边缘不规整,中央深褐 色,外 缘 灰 白 色 (图 2c)。 分 生 孢 子 器 大 小(79.8~253.4)μ×(65.3~140.1)μm,含4~6层拟薄壁组织,外壁黑色,有孔口,呈瓶形或安瓿形(图2d)。产孢细胞安瓿形或瓮形,直径2.5~3.0μm。分生孢子透明、单胞,椭圆形或短棒状,大小(6.5~9.1)μ×(1.8~3.0)μm(图2e)。对病原菌的ITS(引物ITS1/ITS4)和 LSU(引物LR0R/LR7)序列进行PCR扩增[14]和测序,分别获得长度为549bp和1 051bp的 DNA 序列。测序结果在GenBank中进行BLAST比对,结果显示,该病菌(Gen-Bank登录号分别为 KP690076和 KP690077)与菊异茎点霉(Paraphoma chrysanthemicola strain CBS 522.66)的同源性高达98%。利用 Mega 6.0 构建不同异茎点霉的联合系统发育树(图3),显示该病菌与Paraphomachrysanthemicola (strain CBS 522.66和CBS 172.70)聚在一支。致病性测定结果表明,接种后4~5d开始发病,7d后病斑大小为0.4~1.0mm,对照未发病。结合该病的田间危害症状、病原的形态特征、培养性状、致病性测定及多基因(ITS和LSU)鉴定,可确定病原菌为菊异茎点霉(Paraphoma chrysanthemicola)4.png

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     2.2.3 苍术炭疽病苍术炭疽病主要危害叶片,也可危害花萼。初期形成褐色、圆形或不规则形小斑,病健分界明显,随后病斑扩展、合并、深棕色、略凹,成熟病斑表面出现散生或轮纹状排列的小黑点,即分生孢子盘。高湿条件下,病斑上出现大量红色黏质团,即分生孢子团。发病后期叶片变黄、枯萎、脱落,严重时,顶部嫩叶和花萼也可染病(图4a)。病菌分生孢子盘盘状、聚生,黑色或黑褐色;刚毛深褐色,顶端较尖,1~3个隔膜;分生孢子梗圆柱形,无色单胞,顶端略尖,大小为(8.9~28.3)μ×(2.5~3.9)μm(图4c)。分生孢子圆柱形、无隔、光滑,含1~2个油球,大小(13.5~18.6)μ×(3.9~6.6)μm(图4d)。附着胞单胞,灰褐色,椭圆形或不规则形,大小(7.5~13.1)μ×(6.5~10.4)μm(图4e)。PDA 上菌落白色至橘黄色,后期产生灰色或橘黄色棉絮状菌丝,皿背轮纹状,25菌落平均生长速度为3.2mm/d(图4b)。对病原菌的ITS(引物ITS1/ITS4)、GAPDH(引物GDF1/GDR1)、CHS-1(引物 CHS-354R/CHS-79F)、ACT(引物 ACT-512F/ACT-783R)和TUB(引物T1/BT4R)序列进行PCR扩增[16]和测序,分别获得长度为558、196、255、237bp和439bp的DNA序列,GenBank登录号分别为KR149280、KR259334、KR259333、KR132243和 KU058178。利用 Mega 6.0分别构建单基因和多基因联合系统发育树(图5),显示该病菌聚在Colletotrichum destructivum 复合·641·42卷第6期 徐海娇等:辽宁省北苍术病害调查及种类鉴定群[16],与 C.destructivum,C.higginsianum、C.lini 和C.tanaceti关系较近,但独立分成一支。致病性测定结果表明,接种后3~5d开始发病,7d后病斑大小为0.2~0.8mm,对照未发病。结合该病的田间危害症状、病原的形态特征、培养性状、致病性测定及多基因系统发育分析,初步鉴定该菌为炭疽菌(Colletotrichumsp.)

     

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    3 讨论环境条件和栽培品种不同导致地域间病害种类及其发生情况有明显差异。本文对辽宁省主要北苍术种植区进行系统调查,结果表明,危害辽宁北苍术生产的主要病害有3种,为苍术菌核病、苍术叶斑病和苍术炭疽病,与已报道的湖北等地茅苍术的结果差异较大。辽宁省北苍术主要在温带大陆性气候的辽东山区种植,而湖北等南方地区多为亚热带地区,雨 沛,田 湿 大,温 更高,更适宜黑斑病和白绢病等喜高温病菌的发展和蔓延,而这些病害在辽东山区不适于发生和蔓延,因此在调查中未发现白绢病和黑斑病的发生危害。本研究表明,北苍术叶斑病的致病菌为 Pa-raphoma chrysanthemicola,与江苏和湖北等地的茅苍术内分离到的 P.chrysanthemicola 同种,但对茅苍术无致病力,为茅苍术内生菌。同时,在苍术叶斑病菌分离过程中,作者亦分离到大量链格孢菌(Alternariasp.),但致病性测定表明均无致病力,认为是腐生菌,且苍术叶斑病的田间症状与已报道的黑斑病田间症状差异明显,苍术黑斑病病斑黑褐色,湿度大时病斑两面产生黑色霉层,而苍术叶斑病病斑中央白色、边缘黑褐色,湿度大时产生埋生或半埋生的分生孢子器。菌核病多发生在早春,降水量、土壤湿度、低温冻害以及伤口是影响病害发生的主要因素。辽宁北苍术菌核病一般在  月中上旬开始发病,4月下旬至5月为发病盛期,因辽东山区降雨量大,土壤湿度高,早春昼夜温差大,反复冻融现象常见,造成苍术根茎部伤口多、冻伤面积大,利于苍术菌核病的发生和扩展蔓延。国内外学者认为,S.nivalis不易形成子囊盘,其在病组织上以菌丝体或形成菌核越冬,翌年菌丝或菌核萌发直接产生的菌丝侵染寄主,引发菌核病,作者连续  年田间调查自然条件下均未见子囊盘的形成,但生产中菌核病危害严重,这也证明了该病菌以菌丝或菌核直接萌发侵染,病菌以菌丝或菌核在土壤和病组织中越冬。由于药用植物种苗调运频繁,建议选用无病区种苗,移栽前进行种苗消毒,栽培中覆膜覆草等措施进行防冻,降低病害发生率。辽宁已成为我国主要的苍术种植区之一,随着栽培面积增大,种植年限增加,田间各种菌源积累量增多,加之栽培区环境条 件适宜,病害问题现已成为辽宁北苍术产业健康可持续发展的限制性因素之一。苍术菌核病、叶斑病和炭疽病均为辽宁北苍术生产中近年来新发生流行病害,研究历史短,研究基础较为薄弱,有效防控措施单一,病害侵染特性、流行动态及致病机制等方面尚需要进一步深入研究,以满足生产中病害 防 控 的需求,保障辽宁北苍术产业的健康发展

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